故事以一位受过改造和职业训练、成为职业杀手，代号“杀手47”（鲁伯特·佛列德饰）的男人为开场。47是利凡科博士的“探员计画”的一系列成品之一，虽然成果斐然，但利凡科博士为此改造行为深感不安，于是在多年前销声匿迹，许多想要开发超级杀手的公司纷纷追杀他。
在德国柏林，一名女子卡蒂娅·范·迪斯寻找著她持有的一张照片中的一名男子。在车站，“国际联合协会”派出的一名男子约翰·史密斯找上卡蒂娅，自称是来保护她免于47刺杀。躲过47追击后，约翰告诉她她父亲的一些信息，而卡蒂娅照片中的人就是她的父亲——利凡科。卡蒂娅对父亲的位置有所推断，但隐瞒不说。戴安娜要求47在48小时内杀死约翰和卡蒂娅。47找到两人，朝约翰胸口开了数枪，并将卡蒂娅打昏带走。47在卡蒂娅醒来后告诉她，卡蒂娅其实是拥有探员“90”基因的克隆人，她父亲有意增强了她的洞察力和反应力，让她能从中预测未来的威胁，潜力比47还要高出许多。另一方面，胸口中枪的约翰因为全身植入金属，所以并未死亡。
卡蒂娅告诉47，她父亲利特维年科应该在新加坡，而约翰也猜测利特维年科在新加坡——那里也是“国际联合协会”的大本营。47和卡蒂娅攻进新加坡，歼灭了许多佣兵和国际联合协会的人马，但利凡科却意外中弹，无法逃跑而被国际联合协会抓走。47和卡蒂娅直捣国际联合协会的总部，大开杀戒，约翰被47用墙壁内的电线电死，逼得协会主席安东·拉格拉克带著利凡科一路逃到顶楼的直升机平台，准备落跑。到达顶楼后，47和卡蒂娅杀光了拉格拉克的所有手下，但只能眼睁睁地看著拉格拉克带著利凡科乘直升机离开。然而，利凡科随身带了装在呼吸器内的微型炸弹，看了女儿最后一眼后，他按下按钮，直升机在半空中炸得粉碎，利凡科与拉格拉克同归于尽。
最后，47打电话向戴安娜报告，一号目标利特维年科已死亡，戴安娜问是否杀死了二号目标卡蒂娅，47不回答，将手机从楼上扔下去。47和卡蒂娅准备坐电梯下去，正好编号为48的探员克隆人上来了，48说“戴安娜向你们问好”。48、47、卡蒂娅同时开枪。在片尾彩蛋中，倒在地上的约翰突然睁开了眼睛。